用各种可以发荧光的物质来染色微生物样品,如利用荧光染色剂将人的染色体染色，可以通过染色不同，看到显微镜下染色体上的基因
某些化合物可吸吸一定波长的光波后会显示另一个波长的光波，就会在一定条件下显示不同鲜亮的颜色，而这些化合物叫荧光剂或荧光素。荧光染色就是利用荧光剂在不同条件下显色不同而进行工业研究、科学应用、医学分析、核酸检测等。荧光染色在医学又叫免疫荧光技术，是通过免疫学、生物化学、显微镜技术基础建立起的一门技术，在免疫学上通过荧光剂标记某些已知的抗原或抗体，来检查某些组织或细胞所做的标本中相应的抗原或抗体。
这种检查有速度快、敏感性强、特异性高等特点。
免疫荧光技术在医学上主要应用于临床疾病的研究、诊断和指导治疗，是最常用的检查方法。
这种跨膜染料通过观察活死细胞形态来判断细胞活率，中心透亮未着色的为活细胞，被着色呈现实心的为死细胞。近年来随着细胞治疗行业的进步，台盼蓝染色原理已经不能满足复杂的细胞样品的计数，比如原代细胞中的碎片、PBMC中残留的红细胞血小板等杂质碎片、培养后期的细胞，尤其在干细胞、CAR-T、NK等细胞治疗领域台盼蓝计数方法的缺陷尤为突出。
1、简述双抗体夹心法（ELISA）原理定义、操作过程、注意事项。
（1）原理定义：将可溶性的抗原或抗体吸附到固相载体上，并保持其免疫活性，使之结合并吸附结合抗体或抗原，通过洗涤去除未结合成分，再与酶标记的抗体或抗原结合，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被催化变为有色产物，根据反应颜色的深浅进行免疫反应的定性和定量的方法。
（2）操作过程：
①用一直抗体包被固相载体；
②加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；
③加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
（3）注意事项：
①对倍稀释抗原混匀时不要产生太多气泡；
②酶标板要洗涤干净不要交叉污染；
③加样时从最低稀释度逐一加至最高稀释度。
2、比较聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。
（1）相同点：都是电泳方法 ，可用于物质的分离与鉴定。
（2）不同点：前者利用蛋白质分子大小形状的差异进行分离，后者利用的是两性电解质形成的光滑pH使蛋白质停留在与其pI相等的位置上进行分离；前者有扩散的作用，后者无扩散作用，因而物质更集中，分辨率高；电泳时间加长，前者电泳效果会变差，后者可使同一蛋白区带更狭窄，利于分辨。
3、比较向聚丙烯酰胺薄膜层析和凝胶柱层析。
（1）相同点：都是层析方法，可用于分离物质；固定相均为固体，流动相均为液体；与分离物质不发生反应，分离后可鉴定。
（2）不同点：前者属于特殊的吸附分配层析，后者属于分子筛层析；前者通过荧光观察判断分离物质，后者通过收集液的显色反应；前者原理与分离物质与聚丙烯酰胺薄膜形成氢键有关，后者利用分子颗粒大小有关。
4、使牛蛙红细胞细胞融合的试剂及其原理；红细胞计数。
（1）PEG；PEG具有强烈的吸水和凝聚沉淀蛋白质的作用，可改变细胞膜的结构，使两细胞接触点处脂类分子发生分散和重组，引起细胞融合。
（2）计数：格子数；稀释倍数。
5、两种核酸提取的基本要求和鉴定方法。
（1）DNA
基本要求：保持DNA大分子的完整性及纯度；避免机械张力剪切，操作轻柔；注意对杂质蛋白和RNA的去除；防止DNA酶对DNA的降解。
鉴定方法：A260/A280比值在1.8左右；琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭荧光显色，观察条带。
（2）RNA
基本要求：全程要防止RNA酶污染，对实验器具要预先处理，可加入特异性RNA酶抑制剂，实验中要佩戴一次性口罩手套。
鉴定方法：A260/A280比值在2.0左右；琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭荧光显色，观察28S亮度是否为18S两倍。
6、PCR的原理以及反应体系中各组分的作用。
（1）PCR原理：
该技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的情况下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段DNA片段来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。而新合成的链又可作为下一轮反应的模板，如此循环往复，每循环一次，DNA分子数即按指数倍增（2n）。
（2）反应体系中各物质作用：
①模板DNA：DNA复制模板；
②引物：开始阶段结合到DNA模板的一段互补序列部位，启动DNA双链的合成；
③4种脱氧核苷酸：合成DNA原料；
④耐热的DNA聚合酶：催化DNA链合成；
⑤适宜的缓冲液：维持合适pH，以保持酶的活性并帮助DNA解除缠绕结构。
7、小鼠脾单个核细胞的分离，离心后从上到下都是什么成份；分离的原理；淋巴细胞浓度的计算。
（1）从上到下分别是：稀释的血浆；单个核细胞；粒细胞；红细胞。
（2）原理：本次实验根据颗粒沉降原理，将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上进行水平式离心，使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液洁面上；达到分离小鼠脾单个核细胞的目的。已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度约为1.088，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。因此，用密度为1.088±0.001的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心方法，可从小鼠脾脏细胞分离得到单个核细胞。
（3）计数：格子数；稀释倍数。
8、简述对流免疫电泳原理。
对流免疫电泳是电泳技术与双向琼脂扩散技术相融合而形成的一种定向加速的凝胶内免疫沉淀反应。与双向琼脂扩散技术中抗原与抗体分别向四周自由扩散不同，对流免疫电泳在凝胶中加一直流电场，抗原和抗体受到电泳和电渗两种力量的综合作用而向某一方向定向加速移动，因此可以提高灵敏度，明显缩短反应时间。
9、写出2种蛋白质定量方法，并择一详述。
（1）标准曲线法；标准管法。
（2）标准曲线法：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与铜离子络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行鉴定。
10、简述等电聚焦电泳中Ampholine AP TEMED、聚酰胺薄膜、秋水仙素、细胞融合中PEG、DNA纯化中EDTA SDS、CDC实验中石蜡油 抗淋巴血清 细胞培养液 补体 锥蓝的作用。
（1）Ampholine：在直流电场作用下，能从正极到负极形成一个pH逐渐升高的平滑连续而且稳定的pH梯度，从而在电泳中实现等电点不同的物质的分离；
AP：引发凝胶的聚合；
TEMED：加速凝胶的聚合。
（2）聚酰胺薄膜：由于分离物质和展层剂的不同，其与聚酰胺薄膜上的酰胺基团竞争形成氢键的能力也不同，从而可以利用其泳动速度差异，实现不同种物质的分离。
（3）秋水仙素：抑制纺锤体形成，使细胞周期停留在中期，便于观察。
KCl低渗溶液：使得细胞膨胀，利于中期染色体的观察。
（4）PEG：具有强烈的吸水和凝聚沉淀蛋白质的作用，可改变细胞膜的结构，使两细胞接触点处脂类分子发生分散和重组，引起细胞融合。
（5）EDTA：络合二价金属离子，当Mg2+被络合后，细胞内释放出来的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜稳定性下降，有利于膜的裂解；
SDS：使蛋白质变性，能破坏膜蛋白的构象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
（6）石蜡油：密封细胞反应板，防止污染，利于孵育；
抗淋巴血清：作为抗体提供补体结合位点与补体结合，使其活化形成MAC；
细胞培养液：作为抗体的阴性对照；
补体：与抗体的补体结合位点结合，活化形成MAC，检测是否有特异性抗原；
锥蓝：使死细胞着色，通过光学显微镜观察，可以测得死细胞百分率。
1.在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。2.在紫外灯（254nm或365nm）下观察有无暗斑或荧光斑点并记录其颜色、位置及强弱。能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。3.荧光薄层板检测，荧光薄层板是在硅胶中掺入了少量荧光物质制成的板。在254nm紫外灯下，整个薄层板呈黄绿色荧光，被测物质由于荧光猝灭作用而呈现暗斑。4.既无色又无紫外吸收的物质，可采用显色剂显色。
共聚焦显微镜 的优势: 1、高分辨率 16bit。由于是激光和荧光 的共聚焦成像以及Pinhole的应用阻止了焦点以外的干扰衍射光和散射光，共聚焦显微镜的分辨率远非普通荧光显微镜所能及2断层扫描，3断层扫描，4微分干涉成像，5三维重建
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