PCR反应程序指的是：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。
此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。
该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。
传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。
你做的是不是RT-PCR， 这个就是以反转录得到的cDNA为模板的。
我们做的时候一般是提取植物总的RNA，然后采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，主要是获得目的基因或检测基因表达，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。因为直接提取DNA的话，并不能证明该基因在其他细胞体内进行表达，通过这种方法可以克服假阳性。仅供参考。
因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。通过PCR的方法扩增目的基因片段的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：
（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。
鉴于PCR体系一般为30微升以下，一般采取吸打混匀方法，漩涡、手弹、颠倒都会使整个体系挂壁，不能很好混匀。加酶、加模板后也是用吸打的方法。PS：如果模板是基因组DNA，建议用火将枪头烧至无棱角，避免吸打切断基因组一般不需要低速离心，也有一种说法，说低速离心也可以很好的混匀体系，但是考虑到如果甘油没有溶解完全，低速离心会让甘油沉底，不建议采用。
在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数； 相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化. 如果你做的是DNA的定量，可以用DNA 模板。
你用质粒作为标准品做标准曲线，最后可以换算出来拷贝数，这是绝对定量。
如果是做转录，表达量的变化，需要提取RNA，反转录为cDNA，然后再做相对定量。
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